PCR擴增目的基因
王瑞斌1，黃浩哲2
(1. 西南醫科大學，2021級口腔20210499120011)
(2. 西南醫科大學，2021級口腔20210499120017）
摘要：目的：通過PCR技術對目的基因LDH-B進行擴增，再通過瓊脂糖凝膠電泳中的擴增產物條帶與maker條帶進行對比，觀察條帶位置從而判斷目的基因是否擴增成功，熟悉掌握聚合酶鏈式反應（PCR）實驗技術及實驗原理，瞭解PCR擴增引物設計的原理和方法。結果：電泳條帶清晰，各條帶分明，見少許拖影現象，泳道見一明一暗兩條明顯條帶，較淺條帶分子量與目的基因相同。結論：實驗成功擴增目的基因，但條帶不清晰，二者灰度值差異明顯，可能與引物量太多、引物特異性太弱、酶活性降低或PCR程式設計不合理等原因相關。
Abstract: Objective: To amplify the target gene LDH-B by PCR technique, and then compare the amplified product bands with maker bands in agarose gel electrophoresis, observe the position of the bands to determine whether the target gene is amplified successfully, to be familiar with the experimental techniques and principles of polymerase chain reaction (PCR), and to understand the principles and methods of PCR amplification primer design. Results: The electrophoretic bands were clear, each band was distinct, a little trailing phenomenon was seen, two obvious bands were seen in the lane, and the molecular weight of the lighter band was the same as the target gene. Conclusion: The experiment successfully amplified the target gene, but the bands were not clear, and the difference between the two grayscale values was obvious, which might be related to too many primers, too weak primer specificity, reduced enzyme activity or unreasonable PCR program design.
關鍵詞：PCR；目的基因；電泳
1材料與方法
1.1材料、試劑與儀器
上游引物：LDH-B F 5'-CGGGATCCAAAATGGCAACTCTTAAGG-3'
下游引物：LDH-B R 5'-GGGGTACCTCACAGGTCTTTTAGGTC-3'
將這兩條引物序列送生物技術公司合成引物，收到公司合成的引物後分別用滅菌雙蒸水配為10μM引物溶液。
Taq polymerase（天根生化科技有限公司）。
10×TBE電泳緩衝液（pH8.3）：取Tris 108g，Na2EDTA•2H2O 7.44g，硼酸55g置於1L燒杯中，向燒杯中加入約800mL純水，充分攪拌溶解。用純水定容至1L後，室溫儲存。1×TBE電泳緩衝液由10×TBE電泳緩衝液稀釋而來（可稀釋至0.5×TBE使用），用作配製瓊脂糖凝膠和電泳緩衝液。
6×上樣緩衝液：稱取溴酚藍（bromophenol blue）50mg，二甲苯青（xylene cyanol FF）50mg，EDTA 0.88g置於100mL燒杯中，向燒杯中加入40mL純水，加熱攪拌充分溶解；加入36mL甘油（Glycerol）後，使用2N NaOH調pH至7.0；用純水定容至100mL，室溫儲存。
10mg/mL EB溶液：戴手套謹慎稱取溴化乙錠（ethidium bromide，EB）200 mg 於棕色試劑瓶中，加20mL雙蒸水，充分溶解後室溫避光儲存。EB的工作濃度為 0.5g/mL，也可用10mg/mL EB溶液配製5g/mL的EB染色液。EB是一種致癌物質，操作必須小心。
電泳儀、水平電泳槽、移液器、吸頭、1.5mL Eppendorf管（EP管）、一次性手套、錐形瓶、100mL量筒、微波爐、凝膠成像系統、掌式高心機、基因擴增儀
1.2 方法
1.2.1 PCR反應體系的準備
向容積為2.5ml的PE管中依次加入PCR Buffer、dNTPs、LDH-B primer F、LDH-B primer R、Taq polymerase、cDNA template各2.5μl及ddH2O10μl。其中，加入ddH2O時使用量程為10μl的移液槍，其餘試劑使用量程為2.5ml的移液槍加入。將PE管瞬時離心10s。
1.2.2 PCR反應程式的設定
將PE管放置於PCR儀後設定如下迴圈：（1）95℃，30s；（2）60℃，30s（3）72℃，30s。總共迴圈28次。
1.2.3 瓊脂糖凝膠的製備
使用微波爐（中高火）加熱瓊脂糖（2~3min）至清澈透明的溶液，然後用自來水沖洗冷卻至約60℃；將瓊脂糖溶液倒入制膠模具中，凝膠厚度約5mm，注意避免產生氣泡；凝膠完全凝固後，移去梳子。
1.2.4 加樣
PCR結束後，取出樣品，加入5μl 6×loading buffer後混勻，瞬時離心，再將10μl混勻樣品加入到瓊脂糖凝膠樣品孔內。將托盤和凝膠放入電泳槽，注意點樣端放置於靠近負極。TBE緩衝液恰好沒過膠面約1mm。
1.2.5 電泳
調節電壓為130V，電流為0.6mA，通電。待條帶區分開後關閉電源。
1.2.6 染色
EB染色3min，自來水清洗一次
1.2.7 觀察
凝膠成像系統照相儲存。
2 結果與討論
2.1結果
樣品在經過染色後呈現出兩個清晰的條帶，下方的一條較為明顯，上方一條較為暗淡。（如圖1）
圖一 電泳結果
2.2關於實驗結果的討論
2.2.1 瓊脂糖凝膠的製備
瓊脂糖凝膠的內部空隙均勻一致性是電泳條帶整齊均一不出現偏斜的前提，若在制膠時出現未完全溶解就將凝膠倒入平板，會出現凝膠的部分割槽域空隙大小不一從而導致電泳物質的移動速度不一致，出現條帶便宜。瓊脂的濃度和電泳帶位移速度成負相關。
2.2.2 PCR體系的製備
PCR有固定的反應體系成分，包括PCR Buffer、dNTPs、LDH-B primer F、LDH-B primer R、Taq polymerase、cDNA template等各種成分，還有固定體積，通常用ddH2O配到反應體系，加量需準確無誤，並且避免汙染。
2.2.3 電泳條帶
影響DNA條帶扭曲的因素包括電泳緩衝液的種類和濃度、環境溫度、凝膠的均一性、瓊脂糖的生產質量[1]。也與上樣相關，若不小心破壞了凝膠，也會產生條帶的扭曲。該實驗中下方的條帶較上方更明顯更亮，二者灰度值差異明顯，可能是因為引物量太多、引物特異性太弱、酶活性降低或PCR程式設計不合理等原因，從負極往正極分別為DNA產物及引物二聚體。
2.2.4 PCR引物設計原則
①引物與引物之間不應存在互補序列避免形成穩定的二聚體或髮夾結構, 引物與模板的序列要緊密互補。②在選擇用來擴增不同物種DNA的引物時, 應避開m RNA的5′和3′末端非翻譯區序列。③引物長度以及GC含量合適以保證合適的Tm值。④引物3′端不能選擇A, 最好選擇T。⑤引物序列在模板內應當沒有其他相似性較高的序列。⑥引物5′端可以修飾, 3′端不可修飾且要避開密碼子第3位[2]。
3 結論
本實驗通過對LDH-B基因的擴增及檢測，熟悉並練習了實驗的操作過程，對實驗中可能存在的問題和需要注意的細節進行了分析，之後對於實驗結果進行了思考，分析了實驗中各種因素的干擾和影響，鍛鍊了學生的思考能力，通過課後的文獻及資料查詢解決問題，既提高了學生的動手能力也同時反思糾錯的能力，對於建立良好的科研思考模式有較大幫助。
[1]劉陽,楊淑霞,賴翼,李敏惠,胡鬆,鄒強.影響瓊脂糖凝膠電泳條帶扭曲程度的因素[J].生物學雜誌,2009,26(02):70-72.
[2]尤超,趙大球,樑乘榜,周春華引物設計方法綜述[J].現代農業科技,2011(17):48-51.